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GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》


[ 更新時間:2008-10-11 ]

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中華人民共和國國家標準

GB/T 22388—2008

原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法

Determination of melamine in raw milk and dairy products

    2008-10-07 發布                2008-10-07 實施


中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局
    中國國家標準化管理委員會 發布

前言

  本標準包括三個方法:第一法高效液相色譜法,第二法液相色譜-質譜/質譜法,第三法氣相色譜-質譜聯用法,檢測時,應根據檢測對象及其限量的規定,選用與其相適應的檢測方法。
  本標準的附錄A 為資料性附錄。
  本標準由全國食品安全應急標準化工作組、全國質量監管重點產品檢驗方法標準化技術委員會提出并歸口。
  本標準第一法起草單位:中國檢驗檢疫科學研究院、中國疾病預防控制中心、國家食品質量安全監督檢驗中心、北京市疾病預防控制中心、國家乳制品質量監督檢驗中心、浙江省質量技術監督檢測研究院、國家加工食品質量監督檢驗中心(廣州)。
  本標準第一法主要起草人:宋書鋒、魯杰、安娟、楊大進、李淑娟、張晶、劉艷琴、楊紅梅、楊金寶、鄂來明、廖上富、陳小珍、蔡依軍、郭新東、吳玉鑾。
  本標準第二法起草單位:中國檢驗檢疫科學研究院、北京市疾病預防控制中心、國家食品質量安全監督檢驗中心、中國疾病預防控制中心、中華人民共和國江蘇出入境檢驗檢疫局。
  本標準第二法主要起草人:彭濤、吳永寧、邵兵、王浩、李曉娟、郭啟雷、苗虹、趙云峰、丁濤、李立、蔣原。
  本標準第三法起草單位:上海市質量監督檢驗技術研究院、國家食品質量安全監督檢驗中心、中國檢驗檢疫科學研究院。
  本標準第三法主要起草人:巢強國、常宇文、雷濤、陳冬東、趙玉琪、周耀斌、穆同娜、葛宇、曹程明、張輝、麥成華、曹紅。

                        GB/T 22388—2008
原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法

  1 范圍
  本標準規定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的三種測定方法,即高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜/質譜法(LC-MS/MS)和氣相色譜-質譜聯用法[包括氣相色譜-質譜法(GC-MS),氣相色譜-質譜/質譜法(GC-MS/MS)]。
  本標準適用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量測定;液相色譜-質譜/質譜法、氣相色譜-質譜(包括氣相色譜-質譜/質譜)法同時適用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定性確證。
  本標準高效液相色譜法的定量限為2mg/kg,液相色譜-質譜/質譜法的定量限為0.01mg/kg,氣相色譜-質譜法的定量限為0.05mg/kg(其中氣相色譜-質譜/質譜法的定量限為0.005mg/kg)。
  2 規范性引用文件
  下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準,然而,鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本標準。
  GB/T 6682 分析實驗室用水規格和試驗方法
  3 第一法高效液相色譜法(HPLC)
  3.1 原理
  試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取,經陽離子交換固相萃取柱凈化后,用高效液相色譜測定,外標法定量。
  3.2 試劑與材料
  除非另有說明,所有試劑均為分析純,水為GB/T 6682規定的一級水。
  3.2.1 甲醇:色譜純。
  3.2.2 乙腈:色譜純。
  3.2.3 氨水:含量為25%~28%。
  3.2.4 三氯乙酸。
  3.2.5 檸檬酸。
  3.2.6 辛烷磺酸鈉:色譜純。
  3.2.7 甲醇水溶液:準確量取50mL甲醇和50mL水,混勻后備用。
  3.2.8 三氯乙酸溶液(1%):準確稱取10g三氯乙酸于1L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,混勻后備用。
  3.2.9 氨化甲醇溶液(5%):準確量取5mL氨水和95mL甲醇,混勻后備用。
  3.2.10 離子對試劑緩沖液:準確稱取2.10g檸檬酸和2.16g辛烷磺酸鈉,加入約980mL水溶解,調節pH至3.0后,定容至1L備用。
  3.2.11 三聚氰胺標準品:CAS108-78-01,純度大于99.0%。
  3.2.12 三聚氰胺標準儲備液:準確稱取100mg(精確到0.1mg)三聚氰胺標準品于100mL容量瓶中,用甲醇水溶液(3.2.7)溶解并定容至刻度,配制成濃度為1mg/mL的標準儲備液,于4℃避光保存。
  3.2.13 陽離子交換固相萃取柱:混合型陽離子交換固相萃取柱,基質為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物,60mg,3mL,或相當者。使用前依次用3mL甲醇、5mL水活化。
  3.2.14 定性濾紙。
  3.2.15 海砂:化學純,粒度0.65mm~0.85mm,二氧化硅(SiO2)含量為99%。
  3.2.16 微孔濾膜:0.2µm,有機相。
  3.2.17 氮氣:純度大于等于99.999%。
  


3.3 儀器和設備
  3.3.1
高效液相色譜(HPLC)儀:配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。
  3.3.2 分析天平:感量為0.0001g和0.01g。
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  3.3.5 固相萃取裝置。
  3.3.6 氮氣吹干儀。
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3.4 樣品處理
  3.4.1 提取
  3.4.1.1 液態奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等
  稱取2g(精確至0.01g)試樣于50mL具塞塑料離心管中,加入15mL三氯乙酸溶液(3.2.8)和5mL乙腈,超聲提取10min,再振蕩提取10min后,以不低于4000r/min離心10min。上清液經三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后,用三氯乙酸溶液定容至25mL,移取5mL濾液,加入5mL水混勻后做待凈化液。
  3.4.1.2 奶酪、奶油和巧克力等
  稱取2g(精確至0.01g)試樣于研缽中,加入適量海砂(試樣質量的4倍~6倍)研磨成干粉狀,轉移至50mL具塞塑料離心管中,用15mL三氯乙酸溶液(3.2.8)分數次清洗研缽,清洗液轉入離心管中,再往離心管中加入5mL乙腈,余下操作同3.4.1.1中“超聲提取10min,……加入5mL水混勻后做待凈化液”。
  注:若樣品中脂肪含量較高,可以用三氯乙酸溶液飽和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱凈化。
  3.4.2 凈化將3.4.1中的待凈化液轉移至固相萃取柱(3.2.13)中。依次用3mL水和3mL甲醇洗滌,抽至近干后,用6mL氨化甲醇溶液(3.2.9)洗脫。整個固相萃取過程流速不超過1mL/min。洗脫液于50℃下用氮氣吹干,殘留物(相當于0.4g樣品)用1mL流動相定容,渦旋混合1min,過微孔濾膜(3.2.16)后,供HPLC測定。
  3.5 高效液相色譜測定
  3.5.1 HPLC 參考條件
  a) 色譜柱:C8柱,250mm×4.6mm(i.d.),5μm,或相當者;
  C18柱,250mm×4.6mm(i.d.),5μm,或相當者。
  b) 流動相:C8柱,離子對試劑緩沖液(3.2.10)-乙腈(85+15,體積比),混勻。
  C18柱,離子對試劑緩沖液(3.2.10)-乙腈(90+10,體積比),混勻。
  c) 流速:1.0mL/min。
  d) 柱溫:40℃。
  e) 波長:240nm。
  f) 進樣量:20μL。
  3.5.2 標準曲線的繪制用流動相將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋得到的濃度為0.8、2、20、40、80μg/mL的標準工作液,濃度由低到高進樣檢測,以峰面積-濃度作圖,得到標準曲線回歸方程?;勢ヅ浼穎耆矍璋返難稨PLC色譜圖參見附錄A 中的圖A.1。
  3.5.3 定量測定
  待測樣液中三聚氰胺的響應值應在標準曲線線性范圍內,超過線性范圍則應稀釋后再進樣分析。
  3.5.4 結果計算
  試樣中三聚氰胺的含量由色譜數據處理軟件或按式(1)計算獲得:
  樣液中三聚氰胺的峰面積*標準溶液中三聚氰胺的濃度(單位為微克每毫升(µg/mL))*樣液最終定容體積(單位為毫升(mL))*1000
  試樣中三聚氰胺的含量(單位為毫克每千克(mg/kg))=*稀釋倍數……(1)
  標準溶液中三聚氰胺的峰面積*試樣的質量(單位為克(g))*1000
  3.6 空白實驗
  除不稱取樣品外,均按上述測定條件和步驟進行。
  3.7 方法定量限
  本方法的定量限為2mg/kg。
  3.8 回收率
  在添加濃度2mg/kg~10mg/kg濃度范圍內,回收率在80%~110%之間,相對標準偏差小于10%。
  3.9 允許差
  在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
  4 第二法液相色譜-質譜/質譜法(LC-MS/MS)
  4.1 原理
  試樣用三氯乙酸溶液提取,經陽離子交換固相萃取柱凈化后,用液相色譜-質譜/質譜法測定和確證,外標法定量。
  4.2 試劑與材料
  除非另有說明,所有試劑均為分析純,水為GB/T 6682規定的一級水。
  4.2.1 乙酸。
  4.2.2 乙酸銨。
  4.2.3 乙酸銨溶液(10mmol/L):準確稱取0.772g乙酸銨于1L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,混勻后備用。
  4.2.4 其他同3.2。
  4.3 儀器和設備
  4.3.1 液相色譜-質譜/質譜(LC-MS/MS)儀:配有電噴霧離子源(ESI)。
  4.3.2 其他同3.3。
  4.4 樣品處理
  4.4.1 提取
  4.4.1.1 液態奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等
  稱取1 g(精確至0.01g)試樣于50mL具塞塑料離心管中,加入8mL三氯乙酸溶液(3.2.8)和2mL乙腈,超聲提取10min,再振蕩提取10min后,以不低于4000r/min離心10min。上清液經三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后,做待凈化液。
  4.4.1.2 奶酪、奶油和巧克力等
  稱取1g(精確至0.01g)試樣于研缽中,加入適量海砂(試樣質量的4倍~6倍)研磨成干粉狀,轉移至50mL具塞塑料離心管中,加入8mL三氯乙酸溶液(3.2.8)分數次清洗研缽,清洗液轉入離心管中,再加入2mL乙腈,余下操作同4.4.1.1中“超聲提取10min,……做待凈化液”。
  注:若樣品中脂肪含量較高,可以用三氯乙酸溶液飽和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱凈化。
  4.4.2 凈化
  將4.4.1中的待凈化液轉移至固相萃取柱(3.2.13)中。依次用3mL水和3mL甲醇洗滌,抽至近干后,用6mL氨化甲醇溶液(3.2.9)洗脫。整個固相萃取過程流速不超過1mL/min。洗脫液于50℃下用氮氣吹干,殘留物(相當于1g試樣)用1mL流動相定容,渦旋混合1min,過微孔濾膜(3.2.16)后,供LC-MS/MS測定。
  4.5 液相色譜-質譜/質譜測定
  4.5.1 LC 參考條件
  a) 色譜柱:強陽離子交換與反相C18混合填料,混合比例(1:4),150mm×2.0mm(i.d.),5μm,或相當者。
  b) 流動相:等體積的乙酸銨溶液(4.2.3)和乙腈充分混合,用乙酸調節至pH=3.0后備用。
  c) 進樣量:10μL。
  d) 柱溫:40℃。
  e) 流速:0.2mL/min。
  4.5.2 MS/MS 參考條件
  a) 電離方式:電噴霧電離,正離子。
  b) 離子噴霧電壓:4kV。
  c) 霧化氣:氮氣,40psi。
  d) 干燥氣:氮氣,流速10L/min,溫度350℃。
  e) 碰撞氣:氮氣。
  f) 分辨率:Q1(單位)Q3(單位)
  g) 掃描模式:多反應監測(MRM),母離子m/z127,定量子離子m/z85,定性子離子m/z68。
  h) 停留時間:0.3s。
  i) 裂解電壓:100V。
  j) 碰撞能量:m/z127>85 為20V,m/z127>68 為35V。
  4.5.3 標準曲線的繪制
  取空白樣品按照4.4 處理。用所得的樣品溶液將三聚氰胺標準儲備液(3.2.12)逐級稀釋得到的濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5μg/mL的標準工作液,濃度由低到高進樣檢測,以定量子離子峰面積-濃度作圖,得到標準曲線回歸方程?;勢ヅ浼穎耆矍璋返難稬C-MS/MS 多反應監測質量色譜圖參見附錄A 中的圖A.2。
  4.5.4 定量測定
  待測樣液中三聚氰胺的響應值應在標準曲線線性范圍內,超過線性范圍則應稀釋后再進樣分析。
  4.5.5 定性判定
  按照上述條件測定試樣和標準工作溶液,如果試樣中的質量色譜峰保留時間與標準工作溶液一致(變化范圍在±2.5%之內);樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度與濃度相當標準溶液的相對豐度一致,相對豐度偏差不超過表1的規定,則可判斷樣品中存在三聚氰胺。
  表1 定性離子相對豐度的最大允許偏差
  4.5.6 結果計算
  同3.5.4。
  4.6 空白實驗
  除不稱取樣品外,均按上述測定條件和步驟進行。
  4.7 方法定量限
  本方法的定量限為0.01mg/kg。
  4.8 回收率
  在添加濃度0.01mg/kg~0.5 mg/kg濃度范圍內,回收率在80%~110%之間,相對標準偏差小于10%。
  4.9 允許差
  在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。
  5 第三法氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS和GC-MS/MS MS)
  5.1 原理
  試樣經超聲提取、固相萃取凈化后,進行硅烷化衍生,衍生產物采用選擇離子監測質譜掃描模式(SIM)或多反應監測質譜掃描模式(MRM),用化合物的保留時間和質譜碎片的豐度比定性,外標法定量。
  5.2 試劑與材料
  除非另有說明,所有試劑均為分析純,水為GB/T 6682規定的一級水。
  5.2.1 吡啶:優級純。
  5.2.2 乙酸鉛。
  5.2.3 衍生化試劑:N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)+三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1),色譜純。
  5.2.4 乙酸鉛溶液(22 g/L):取22g乙酸鉛用約300mL水溶解后定容至1L。
  5.2.5 三聚氰胺標準溶液:準確吸取三聚氰胺標準儲備液(3.2.12)1 mL 于100 mL 容量瓶中,用甲醇定容至刻度,此標準溶液1mL相當于10μg三聚氰胺標準品,于4℃冰箱內儲存,有效期3個月。
  5.2.6 氬氣:純度大于等于99.999%。
  5.2.7 氦氣:純度大于等于99.999%。
  5.2.8 其他同3.2。
  5.3 儀器和設備
  5.3.1 氣相色譜-質譜(GC-MS)儀:配有電子轟擊電離離子源(EI)。
  5.3.2 氣相色譜-質譜/質譜(GC-MS/MS)儀:配有電子轟擊電離離子源(EI)。
  5.3.3 電子恒溫箱。
  5.3.4 其他同3.3。
  5.4 樣品處理
  5.4.1 GC-MS法
  5.4.1.1 提取
  5.4.1.1.1 液態奶、奶粉、酸奶和奶糖等
  稱取5g(精確至0.01g)樣品于50mL具塞比色管,加入25mL三氯乙酸溶液(3.2.8),渦漩振蕩30 s,再加入15mL三氯乙酸溶液,超聲提取15min,加入2mL乙酸鉛溶液(5.2.4),用三氯乙酸溶液定容至刻度。充分混勻后,轉移上層提取液約30mL至50mL離心試管,以不低于4000r/min離心10min。上清液待凈化。
  5.4.1.1.2 奶酪、奶油和巧克力等
  稱取5g(精確至0.01g)樣品于50mL具塞比色管中,用5mL熱水溶解(必要時可適當加熱),再加入20mL三氯乙酸溶液(3.2.8),渦漩振蕩30s,再加入15mL三氯乙酸溶液超聲提取及以下操作同5.4.1.1.1。若樣品中脂肪含量較高,可以先用乙醚脫脂后再用三氯乙酸溶液提取。
  5.4.1.2 凈化
  準確移取5mL的待凈化濾液至固相萃取柱(3.2.13)中。再用3mL水、3mL甲醇淋洗,棄淋洗液,抽近干后用3mL氨化甲醇溶液(3.2.9)洗脫,收集洗脫液,50℃下氮氣吹干。
  5.4.2 GC-MS/MS法
  5.4.2.1 奶粉、奶酪、奶油、巧克力和奶糖等
  稱取0.5g(精確至0.01g)試樣,加入5mL甲醇水溶液(3.2.7),渦旋混勻2 min后,超聲提取15min ~20min,以不低于4000r/min離心10min,取上清液200µL用微孔濾膜(3.2.16)過濾,50℃下氮氣吹干。
  5.4.2.2 液態奶和酸奶等
  稱取1g(精確至0.01g)試樣,加入5mL甲醇,渦旋混勻2min后,超聲提取及以下操作同5.4.2.1。
  5.4.3 衍生化
  取上述氮氣吹干殘留物,加入600μL的吡啶和200μL衍生化試劑(5.2.3),混勻,70℃反應30min后,供GC-MS或GC-MS/MS法定量檢測或確證。
  5.5 氣相色譜-質譜測定
  5.5.1 儀器參考條件
  5.5.1.1 GC-MS參考條件
  a) 色譜柱:5%苯基二甲基聚硅氧烷石英毛細管柱,30m×0.25mm(i.d.)×0.25μm,或相當者。
  b) 流速:1.0mL/min。
  c) 程序升溫:70℃保持1min,以10℃/min 的速率升溫至200℃,保持10min。
  d) 傳輸線溫度:280℃。
  e) 進樣口溫度:250℃。
  f) 進樣方式:不分流進樣。
  g) 進樣量:1μL。
  h) 電離方式:電子轟擊電離(EI)。
  i) 電離能量:70eV。
  j) 離子源溫度:230℃。
  k) 掃描模式:選擇離子掃描,定性離子m/z 99、171、327、342,定量離子m/z 327。
  5.5.1.2 GC-MS/MS 參考條件
  a) 色譜柱:5%苯基二甲基聚硅氧烷石英毛細管柱,30m×0.25mm(i.d.)×0.25μm,或相當者。
  b) 流速:1.3mL/min。
  c) 程序升溫:75℃保持1min,以30℃/min 的速率升溫至220℃,再以5℃/min的速率升溫至250℃,保持2min。
  d) 進樣口溫度:250℃。
  e) 接口溫度:250℃。
  f) 進樣方式:不分流進樣。
  g) 進樣量:1µL。
  h) 電離方式:電子轟擊電離(EI)。
  i) 電離能量:70eV。
  j) 離子源溫度:220℃。
  k) 四級桿溫度:150℃。
  l) 碰撞氣:氬氣,1.8mTorr。
  m) 碰撞能量:15V。
  n) 掃描方式:多反應監測(MRM),定量離子m/z342>327,定性離子m/z342>327,342>171。
  5.5.2 標準曲線的繪制
  5.5.2.1 GC-MS法
  準確吸取三聚氰胺標準溶液(5.2.5)0、0.4、0.8、1.6、4、8、16mL 于7 個100mL 容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度。各取1mL用氮氣吹干,按照5.4.3步驟衍生化。配制成衍生產物濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2μg/mL的標準溶液。反應液供GC-MS測定。以標準工作溶液濃度為橫坐標,定量離子質量色譜峰面積為縱坐標,繪制標準工作曲線。標準溶液的GC-MS選擇離子質量色譜圖參見附錄A中的圖A.3,三聚氰胺衍生物選擇離子質譜圖參見附錄A中的圖A.4。
  5.5.2.2 GC-MS/MS法
  準確吸取三聚氰胺標準溶液(5.2.5)0、0.04、0.08、0.4、0.8、4、8mL分別于7個100mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度。各取1mL用氮氣吹干,按照5.4.3步驟衍生化。配制成衍生化產物濃度分別為0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1μg/mL的標準溶液。反應液供GC-MS/MS測定。以標準工作溶液濃度為橫坐標,定量離子質量色譜峰面積為縱坐標,繪制標準工作曲線。標準溶液的GC-MS/MS多反應監測質量色譜圖參見附錄A中的圖A.5。
  5.5.3 定量測定
  待測樣液中三聚氰胺的響應值應在標準曲線線性范圍內,超過線性范圍則應對凈化液稀釋,重新衍生化后再進樣分析。
  5.5.4  定性判定
  5.5.4.1 GC-MS法
  以標準樣品的保留時間和監測離子(m/z 99、171、327和342)定性,待測樣品中4個離子(m/z99、171、327和342)的豐度比與標準品的相同離子豐度比相差不大于20%。
  5.5.4.2  GC-MS/MS法
  以標準樣品的保留時間以及多反應監測離子(m/z 342>327、342>171)定性,其他定性判定原則同4.5.5。
  5.5.5 結果計算
  同3.5.4。
  5.6 空白實驗
  除不稱取樣品外,均按上述測定條件和步驟進行。
  5.7 方法定量限
  本方法中,氣相色譜-質譜法(GC-MS法)的定量限為0.05mg/kg,氣相色譜-質譜/質譜法(GC-MS/MS法)的定量限為0.005mg/kg。
  5.8 回收率
  GC-MS法:在添加濃度0.05mg/kg~2mg/kg濃度范圍內,回收率在70%~110%之間,相對標準偏差小于10%。
  GC-MS/MS法:在添加濃度0.005mg/kg~1mg/kg濃度范圍內,回收率在90%~105%之間,相對標準偏差小于10%。
  5.9 允許差
  在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。

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